PCR?

PCR bukanlah pacar. PCR disini adalah singkatan dari Polymerase Chain Reaction. Makanan apakah itu PCR? Eits, itu juga bukan nama makanan.

DNA?

(Pengertian)

    PCR adalah reaksi polimerase berantai, yaitu reaksi yang melibatkan enzim polimerase yang dilakukan secara berulang-ulang. Yang diulang-ulang adalah proses pemisahan untai ganda DNA menjadi untai tunggal, hibridisasi primer untuk mengawali replikasi DNA dilanjutkan dengan proses penambahan basa pada cetakan DNA oleh enzim polimerase, untuk melakukan kegiatan ini dibutuhkan tabung PCR yang bersifat reponsif dengan perubahan suhu dan mesin thermal cycler, suatu mesin yang mampu menaikkan dan menurunkan suhu dengan cepat, dan bahan-bahan untuk membuat reaksi PCR.

(Tujuan PCR)
Saat ini PCR juga sering digunakan untuk membuat fragmen DNA spesifik untuk diinsersikan secara langsung ke dalam suatu vektor, sehingga tidak memerlukan tahapan screening suatu perpustakaan DNA.

(Komponen PCR)
1. DNA
DNA yang dimaksud disini adalah DNA yang berfungsi sebagai cetakan (template). Untuk aplikasi PCR, kemurnian DNA mempengaruhi hasil. DNA yang tidak murni sering menyebabkan masalah reproduksibilitas, tujuan utama juga digunakan untuk diagnosis. DNA yang digunakan harus dimurnikan dahulu sebelum diproses dengan PCR. DNA yang digunakan sebagai cetakan untuk PCR sebaiknya bebas nuklease, endo-atau eksoprotease, dan DNA-binding protein.

2. Primer
Primer berfungsi mengawali reaksi replikasi DNA pada reaksi PCR. Primer yang dibutuhkan untuk PCR biasanya satu pasang yaitu primer forward dan backward. Primer PCR sendiri adalah komponen yang sangat menentukan keberhasilan PCR. Ada beberapa program untuk mendesain primer PCR yang dapat digunakan secara gratis, seperti MEDUSA, Primer3, PrimerQuest, FastPCR, dan lain-lain.

3. dNTP (Deoxynucleotide triphosphate)
dNTP merupakan blok pembangun molekul asam nukleat yang terdiri dari dATP (deoxydenosine tryphosphatase), dTTP (deoxythymidine triphophatase), dCTP (deoxycytosne triphosphate), dan dGTP (deoxyguanosine triphosphatase). Dalam beberapa aplikasi dan protokol PCR, salah satu dari empat dNTP tersebut dapat diganti elemen analog. Modifikasi ini berguna untuk aplikasi yang berbasis pasca-PCR (misalnya sekuensing, pembuatan probe untuk Southern blotting, dll).

4. Polimerase DNA
Ketika terjadi sintesis DNA, enzim polimerase DNA akan melakukan seleksi nukleotida yang tepat untuk ditambahkan ke primer untuk melanjutkan DNA sesuai dengan aturan pasangan basa Watson-Crick (A-T dan G-C). Oleh karena itu, Polimerase DNA selalu mengkatalis sintesis DNA dalam orientasi 5' ke 3'. Beberapa polimerase DNA juga memiliki aktivitas eksonuklease atau yang sering disebut dengan aktivitas proofreading yang akan memeriksa basa yang telah ditambahkan untuk menumbuhkan untai DNA. Ketika terjadi penambahan nukleotida yang tidak tepat aktivitas proofreading tersebut akan membuang basa yang tidak tepat tersebut.
Mekanisme koreksi ini akan meningkatkan akurasi atau yang disebut juga dengan fidelitas. Ketika membandingkan atau memilih polimerasi DNA untuk PCR ada dua hal yang penting yang harus dilihat yaitu fidelitasnya dan efisiensi sintesisnya. Yaitu makin tinggi fidelitas dan efisiensi sintesisnya makin baik polimerase DNA tersebut (dan makin mahal juga harganya).

Gambar 1. Struktur DNA double helix

Sumber: https://www.researchgate.net

5. Buffer reaksi PCR
Buffer reaksi PCR biasanya mengandung Mg2+, kation monovalen, dan beberapa co-solvent. Co-solvent membantu menstabilisasi enzim polimerase DNA, mempengaruhi kerja enzim, dan atau DNA melting temperature (Tm). Ion monovalen seperti Na+, K+, dan NH4+ menstimulasi aktivitas polimerase DNA dan melindungi muatan negatif gugus fosfat DNA, sehingga melemahkan kekuatan-kekuatan elektronik yang saling menolak antara primer dan DNA target.

(Prinsip Dasar Reaksi PCR)
PCR merupakan teknik amplifikasi DNA selektif in vitro yang meniru fenomena replikasi DNA in vivo. Komponen reaksi yang diperlukan dalam teknik ini adalah untai tunggal DNA sebagai cetakan (DNA template), primer (sekuens oligonukleotida yang mengkomplementeri akhiran sekuens cetakan DNA yang sudah ditentukan), dNTPs (deoxynucleotide triphosphates), dan enzim Taq polimerase yaitu enzim dari bakteri Thermophilus aquaticus.

Sejak ditemukannya struktur DNA untai ganda, kita mulai memahami prinsip replikasi DNA terutama kaitannya dengan mekanisme transfer materi genetik. Seperti yang telah dijelaskan dalam materi asam nukleat dalam struktur DNA untai ganda tersebut, basa A dan T, juga G dan C, memiliki ikatan hidrogen yang mudah dirusak dan mudah dibentuk kembali. Untuk melakukan replikasi, mula-mula ikatan hidrogen tersebut harus dirusak dahulu agar DNA untai gantda berubah menjadi untai tunggal. Kemudian karena A selalu berpasangan dengan T, dan C selalu berpasangan dengan G, maka jika kita memiliki satu untai DNA dengan sekuens ACTAG, misalnya, maka kita dapat mencetak untai komplementernya, yaitu TGATC, begitu juga sebaliknya.

Gambar 2. Mesin PCR

Sumber: http://www.bio-rad.com/

Pada prinsipnya, reaksi PCR (protokol PCR konvensional) membutuhkan tiga tahap :

1.      Denaturasi (Melting)

Prinsipnya adalah memisahkan DNA untai ganda menjadi komponen untai tunggal, sehingga memungkinkan terjadinya hibridisasi primer PCR untai tunggal pada sekuen targetnya.

2.      Annealing Primer PCR

Pada tahap ini terjadi hibridisasi primer PCR pada sekuens targetnya. Secara umum suhu annealing PCR biasanya berasal dari suhu annealing primer hasil kalkulasi matematis dikurangi 50C (rumus 4x (G+C) + 2x(A+T)). Diharapkan dalam suhu annealing tersebut primer dapat berikatan dengan target komplementarinya dan jika sudah terhibridisasi tidak mudah mengalami disosiasi. Waktu yang dibutuhkan untuk tahapan ini biasanya 15-60 detik.

3. Elongasi (ekstensi rantai DNA)

Tahap ini penting untuk mengamplifikasi daerah yang sudah dihibridisasi oleh primer, dari akhiran 5' ke akhiran 3'. Sebagian besar enzim polimerase membutuhkan suhu elongasi 72C. Hal yang perlu dipertimbangkan dalam menentukan langkah elongasi adalah waktu inkubasi, yaitu sebaiknya cukup lama bagi polimerase DNA untuk mengamplifikasi sekuens target secara komplit tetapi cukup sebentar untuk mencegah amplifikasi produk non-spesifik yang lebih panjang daripada sekuens target.

(Aplikasi PCR di Bidang Klinis)

Aplikasi PCR utama di bidang klinis adalah untuk diagnosis dan kloning. Yang paling sering dipakai di bidang klinis saat ini adalah untuk diagnosis, yaitu untuk deteksi patogen infeksius dan identifikasi mutasi pada gen yang berkaitan dengan faktor resiko penyakit.

Untuk aplikasi PCR di bidang klinis tersebut, telah dikembangkan berbagai macam teknis berbasis PCR, antara lain:

1. RFLP-PCR (Restriction Fragment Lenght Polymorphisms)

Pada prinsipnya, teknik ini dimanfaatkan untuk deteksi polimorfisme. Secara umum teknik ini menggunakan enzim restriksi untuk mengetahui adanya polimorfisme (RFLP), dan produk hasil digesti tersebut diamplifikasi dengan PCR (RFLP-PCR).

Teknik PCR yang mirip dengan teknik diatas AFLP-PCR (Amplification Fragment Lenght Polymorphisme) yang digunakan untuk membedakan isolat atau spesies yang berbeda berdasarkan daerah enzim restriksi (polimorfisme daerah restriksi).

2. VNTR-PCR (Variable Number of Tandem Repeats Sequence), dan STR-PCR (Short Tandem Repeats). Teknik ini sering digunakan untuk tujuan forensik. Dengan menggunakan primer yang tepat, varasi sekuens pengulangan berurutan yang terdapat pada DNA sampel dapat diketahui.

3. Screening atau deteksi mutasi berbasis PCR

Dahulu, screening atau deteksi mutasi dapat dilakukan dengan PCR konvensional (misalnya BESS-T-Scan (Base Excision Sequence Scanning) untuk mendeteksi mutasi T/A atau T/A, atau Amplification Refractory Mutation System (ARMS) untuk deteksi point mutation melalui priming oligonukleotida kompetitif.

4. PCR Kuantitatif

Untuk keperluan diagnosis dan penilaian kemajuan tetapi kadang membutuhkan pemeriksaan yang bersifat kuantitatif. PCR konvensional dapat digunakan untuk mendapatkan data kuantitatif tersebut dengan menggunakan kompetitor (internal exogenous standard) atau dengan housekeeping gene (internal endogenous standard). Namun saat ini, penggunaan PCR konvensional untuk PCR kuantitatif telah digantikan real-time PCR.

Sumber:

Budi, Siska. 2012. PCR (Polymerase Chain Reaction). http://siska-theanalyst.blogspot.com/2012/06/pcr-polymerase-chain-reaction.html. Diakses pada 29 Oktober 2018. 

Fragmen: Bagian-bagian